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探索高毒性且高抗藥性的克雷伯氏肺炎桿菌曝露於抗生素下，其小RNA參與調控的機制

為了解決w124整理的問題，作者王琳翔 這樣論述：

中文摘要 iAbstract ii目錄 iii圖目錄 v表目錄 vii第1章 背景介紹 11.1 細菌 small RNAs (sRNA) 的研究近況 11.1.1 Small RNAs提供細菌的基因調控作用 11.2 Small RNA 的種類及作用機制 11.2.1 sRNA調控細菌的抗藥性及毒性 41.3 Regulatory leader sequences (RLSs) 51.4 克雷伯氏肺炎桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌的特性、克雷伯氏肺炎桿菌 sRNA 的研究 61.4.1 克雷伯氏肺炎桿菌 (Klebsiella

pneumoniae) 61.4.2 Carbapenem Resistent K. pneumoniase (CRKp) 71.4.3 TVGHCRE225 71.4.4 目前已知細菌中的 sRNA 重要調控功能 81.4.5 已有文獻尋找細菌sRNA基因的實驗及生物資訊方法 101.4.6 迄今 (2019) 克雷伯氏肺炎桿菌 sRNA 調控毒性及抗藥性的相關文獻不多 121.4.7 使用跨物種之sRNA保留度特性，找出 TVGHCRE225 基因體上候選的 sRNA 基因 131.4.8 研究目的 14第2章 材料與方法 152.1

以small RNA-seq 尋找在壓力狀況下，表現量改變的 sRNAs 152.1.1 實驗設計 152.1.2 small RNA-seq 數據結果之資料前處理 162.1.3 利用FastQC樣本品質控管 192.1.4 透過MultiQC整理資料前處理工具之結果 192.1.5 使用Timmomatic清理序列資料中品質不佳區段及長度不足20 bp 之讀序 192.1.6 使用Cutadapt清理序列資料中因PCR實驗使用的adaptor序列 202.1.7 使用 Bowtie 將 sRNA-seq 讀序結果，和 TVGHCRE225 基因體

比對，並透過Bedtools計算 sRNA 表現量 202.1.8 使用edgeR分析不同抗生素處理下，表現量具顯著差異的sRNAs 212.2 基於序列相似性的方法對 TVGHCRE225 基因體進行sRNA 基因註解 212.2.1 使用其他物種經實驗驗證過的 sRNA 序列對KP TVGHCRE225 基因體做序列相似性比對 222.2.2 使用 Rfam CM model 及 Infernal 註解 KP TVGHCRE225 基因體上的 RNs 篩選出可能之 sRNAs 242.3 找尋 TVGHCRE225 基因體可能的 sRNA 起始轉錄位點(tra

nscription start sites, TSSs) 242.4 TransTermHP: 預測 TVGHCRE225 基因體 sRNA 的轉錄終止位點 (transcription termination sties, TTSs) 252.5 觀測不同抗生素的狀況下，TVGHCRE225 分離株，不同長度 sRNA 表現量之變化 262.6 建立 TVGHCRE225 sRNA-mRNAs 調控配對圖譜 272.7 預測 TVGHCRE225 sRNA 結合的目標 mRNA 29第3章 結果 313.1 TVGHCRE225 各樣本 sRNA-seq

的資料品質控管 (QC) 及品質保證 (QA) 313.2 TVGHCRE225 全基因體註解(Genome-wide annotation) sRNA 基因 393.2.1 TVGHCRE225基因體上已知sRNAs 393.2.2 以序列相似性比對結果及TransTermHP預測方法，分別找出TVGHCRE225 基因體上轉錄起始位點 (TSS) 和轉錄終止位點 (TTS) 423.2.3 支持已知的 sRNAs在 TVGHCRE225分離株的基因表現證據 503.2.4 各sRNA-seq表現量數據的相似性，是否與抗生素處理種類與時間相關 523.3

定義TVGHCRE225新穎的sRNA基因 543.4 找出經抗生素處理下，表現量具有顯著差異之sRNAs，並探索其調控機制 563.4.1 在colistin 及tigecycline 抗生素處理下，具顯著表現量下降的 sRNAs 563.4.2 在colistin及tigecycline 抗生素處理下，具顯著表現量上升的 sRNAs 593.4.3 Colistin及tigecycline 抗生素處理下，表現量具顯著差異之新穎 sRNAs 613.4.4 TVGHCRE225 基因體中參與調控壓力反應 (stresss response) 機制的sRNAs

633.5 TVGHCRE225 之 sRNAs-mRNAs 調控配對圖譜 63第4章 結論與討論 754.1 細菌基因體中sRNA isoform存在的可能，以及其調控機制是否會有所差異 754.2 以TVGHCRE225 基因體 sRNA 結合的目標基因，探索sRNAs 是否可能具備的其它調控機制 784.3 探索與 KP 親緣性相近物種之 sRNA 保留度及未來應用 834.4 探索 TVGHCRE225 基因體新穎的 sRNA 功能 834.5 結論 84參考文獻 85

利用小型干擾RNA抑制石斑魚虹彩病毒之效果

為了解決w124整理的問題，作者林韋任 這樣論述：

核醣核酸干擾 (RNA interference, RNAi) 是藉由小型干擾RNA造成特定基因沉默化，在近幾年來被詳細的研究並被應用作為病毒病害防治的策略。本研究針對蛙病毒屬之石斑魚虹彩病毒 (grouper iridovirus, GIV) 的主要外鞘蛋白 (major capsid protein, MCP) 做為標靶基因，依照各個設計準則合成五段siRNA，分別為siR376、siR588、siR1133、siR807和siR1270，並且藉由活體外 (in vitro) 和活體試驗 (in vivo) 評估此五段siRNA的抑制GIV效果。首先利用螢光標定的siRNA在兩種石斑魚細

胞株，分別為石斑魚鰭細胞 (grouper fin, GF-1) 及石斑魚泳鰾細胞 (swim bladder) 上測試轉染效率，結果顯示在siRNA濃度達100 nM時，兩種細胞的轉染效率分別可達95.3%及75.5%。接著在GF-1細胞株上以共轉染實驗測定五段siRNA抑制pcDNA3-EGFP-stopMCP質體表現MCP基因，其中siR376的抑制效果達50% 為最佳。進一步由GIV感染兩種細胞株產生的細胞病變進程與MCP表現分析，測試以上五段siRNA抑制病毒複製的效果，結果同樣是siR376效果最佳、其次為siR807。且因siRNA對PNP基因沒有任何作用，證實siRNA抑制MC

P基因的專一性。最後以DOTAP攜帶siRNA進行活體抗病毒試驗，結果負控制組和病毒組在病毒攻擊第七天後魚隻全數死亡，而si376和siR807兩組的累計死亡率分別為66.7%及60.0%，雖有保護成效，但效果不顯著。後續應嘗試利用不同劑量，再次評估siRNA的活體抗病毒效果。