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魚類乳酸球菌之分子流行病學、快速診斷及其疫苗效力之研究

為了解決Suzuki Carry通病的問題，作者蔡明安 這樣論述：

乳酸球菌（Lactococcus garvieae）是造成世界上多種淡海水魚類乳酸球菌症的重要革蘭氏陽性菌病原，亦是一種在人類與動物間感染病例逐年增加的人畜共通病原。在台灣，本病症常見於夏季，主要感染包括烏魚及淡水長臂大蝦，然而近年來豆仔魚、吳郭魚、石斑魚、日本鰻、赤目豆、黃鰭鯛及牛蛙等養殖水生動物亦發現有感染跡象，因此本研究收集自1999到2006年間台灣76株乳酸球菌菌株、3株日本青魽鰺乳酸球菌菌株及牛源標準株進行其分子流行病學相關性研究，利用限制酶Apa I 與 Sma I切割不同水生動物來源之乳酸球菌染色體DNA後以脈衝式膠體電泳分析（pulsed field gel electro

phoresis，PFGE），共獲得10種基因型。而台灣養殖魚類所流行之L. garvieae主要以A1/S1基因型為主（佔96.9％），且具有高度同源性。在毒力試驗結果則以A1/S1及A11a/S11基因型L. garvieae對烏魚及吳郭魚具有較高的致病性。此外亦以乳酸球菌alpha/beta fold family hydrolase 基因設計引子發展恆溫圈環型擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）用於魚類乳酸球菌之檢測，反應溫度及時間所測得之最佳條件分別為60℃與60分鐘，且反應後之產物可利用SYBR Green I直接肉眼判讀

。另外本研究設計LAMP引子對於檢測菌落數的靈敏度可高於聚合酶鏈鎖反應100倍，僅300菌落數即可被檢出，在感染魚隻樣本檢測亦優於聚合酶鏈鎖反應。由此結果證明本次建立之LAMP應用在魚類乳酸球菌的檢測是一具特異性、快速、簡易及有效的方法。魚類乳酸球菌在台灣尚未有疫苗成功研發之際，本研究利用大腸桿菌表現系統進行乳酸球菌之3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）之選殖並表現出44 kDa的重組GAPDH蛋白，進而分析乳酸球菌之GAPDH其核酸及胺基酸序列發現其他乳酸球菌與相關鏈球菌的相似度高達80.4-100％。另以吳郭魚

為測試魚種，分別以乳酸球菌福馬林不活化全菌菌苗、重組GAPDH蛋白（50μg）與兩者組合疫苗進行免疫，對照組則注射生理食鹽水，在免疫後第四週可見單獨全菌菌苗、重組GAPDH蛋白（50μg）與兩者組合疫苗的特異性抗體力價皆有明顯升高，且乳酸球菌全菌與重組GAPDH組合疫苗組之相對存活率達100％，其次分別為全菌菌苗（87.5％）與重組GAPDH蛋白（50％），足見乳酸球菌之重組GAPDH蛋白確實有加乘死菌疫苗之功效。

腸內桿菌科不同菌屬含blaCMY-2的質體分析及blaCMY-2表現的調控與台中地區人類及雞隻分離的腸炎沙門氏菌之親緣探討

為了解決Suzuki Carry通病的問題，作者王美惠 這樣論述：

非傷寒沙門氏菌是人畜共通病原菌，也是人類食物中毒的主要原因，非傷寒沙門氏菌大部份會造成輕微的腸胃症狀，但不需使用抗生素治療此菌的感染；而沙門氏菌感染免疫能力較差的人類如嬰兒或老人，會造成菌血症，則需要使用抗生素來治療。現在臨床上沙門氏菌通常都是使用頭孢黴素類抗生素，例如：頭孢黴素類之ceftriaxone (CRO)來治療侵入性型的沙門氏菌感染及嚴重的下痢。近年來非傷寒沙門氏菌中D血清群沙門氏菌為食物中毒常見之菌株，且引起沙門氏症D血清群沙門氏菌分離株亦有逐漸上升之趨勢，除了治療人類使用之抗生素而導致抗藥性增加外，飼養家禽時添加抗生素也能導致抗藥性菌株產生，並經食物傳染給人類。所以本研究為兩

大主題：第一是探討對ceftriaxone (CRO)抗藥的傳遞機制及第二是腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)是否會在人類與雞隻間傳遞。第一：ceftriaxone (CRO)抗藥的傳遞機制收集對 CRO抗藥表現的4種不同菌種，包括Salmonella enterica serovar Choleraesuis、S. Typhimurium、S. Stanley及Shiegella sonnei，共有17株菌株。先以PCR及南方墨點雜交法確定抗藥性基因blaCMY-2位置，並將alkaline method純化的質體DNA，轉形進入E. coli pir116中，分析

這些blaCMY-2質體的抗藥性。由於blaCMY-2的基因結構不同，因此以PCR增幅這些質體所攜帶的blaCMY-2基因結構是否與轉位子有關的ISEcp-1-like tnpA-blaCMY-2-blc-sugE基因順序及大小相同，近而以Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)分析帶有blaCMY-2基因的質體親緣性；最後進行conjugation以分析這些blaCMY-2質體是否能在腸內菌科間傳遞。結果顯示不同的菌種都對CRO具抗藥性，以PCR及Southern blot方法證實CRO抗藥基因blaCMY-2位在質體上，而且都是具有IS

Ecp-1-like tnpA-blaCMY-2-blc-sugE的相同基因結構。將具blaCMY-2質體以限制酶HindIII處裡，發現這些質體分成五種不同的限制酶圖譜。S. Typhimuirum質體pS23與S. sonnei的兩種質體pSHH21和pSHH22 有相同的限制酶圖譜，顯示這三種質體為同一質體；再利用PCR增幅質體的oriT區域，發現這些質體都帶有與含blaCMY-2的pSC138相同的oriT區域。第二：腸炎沙門氏菌是否會在人類與雞隻間傳遞 收集中國醫藥大學附設醫院從人類分離的28株腸炎沙門氏菌 (S. Enteritidis)及台中地區從雞隻分離的的39株沙門氏菌

，先進行抗生素敏感性試驗以測定不同菌株的抗藥性，以Kado & Liu method分析菌株的質體數目及種類，並以PCR方式增幅spvC及純化的spvC之PCR產物作探針，以確定毒性質體的存在；最後以PFGE分析人類及雞隻分離的腸炎沙門氏菌的親緣性。抗生素敏感性試驗結果顯示，來自雞隻腸炎沙門氏菌有較高的抗藥性，有16株 (23.88%)對streptomycin (STR)及17株 (25.37%)對tetracycline (TET)有抗藥性；而人類分離株則只有5株 (7.46%)對STR和7株 (10.44%)對TET有抗性，另外有2株 (2.98%)對sulfamethoxazole-t

rimethoprim (SXT)有抗性；而雞隻對STR抗性在不同年度間有顯著差異，94年菌株都有較高抗藥性而95年菌株則對STR沒有抗藥性。人類及雞隻分離的腸炎沙門氏菌都帶有60 kb的毒性質體 (pSEV)，部分菌株帶有36.6 kb、6 kb或3.6 kb的非毒性質體。以PFGE分析人與雞隻分離的腸炎沙門氏菌基因型，可發現由人類分離的腸炎沙門氏菌基因型可分為8種subtype (1a-1h)，主要是1a及1c基因型；而雞隻分離的腸炎沙門氏菌基因型則只有4種subtype (1a, 1b, 1c, 1g)，主要是1a及1b，也就是1a是人類及雞隻分離的腸炎沙門氏菌共有的主要基因型，1c可能

是感染人類及1b可能是感染雞隻的特異沙門氏菌基因型。