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國立中興大學 昆蟲學系所 戴淑美所指導 趙宇翔的 抗百滅寧與抗安丹埃及斑蚊的比較轉錄體分析 (2016),提出zs-3030關鍵因素是什麼,來自於埃及斑蚊、抗藥性、合成除蟲菊、比較轉錄體分析。
而第二篇論文國防醫學院 生命科學研究所 岳嶽所指導 吳仁煌的 發展及應用新穎反向遺傳技術以研究黃病毒 之生活史 (2014),提出因為有 登革熱病毒的重點而找出了 zs-3030的解答。
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抗百滅寧與抗安丹埃及斑蚊的比較轉錄體分析
為了解決zs-3030 的問題,作者趙宇翔 這樣論述:
埃及斑蚊 (Aedes aegypti)為傳播重要蚊媒病毒感染症 (Mosquito-borne viral infection)登革熱 (dengue fever)與茲卡病毒感染症 (zika virus infection)的主要媒介,目前仍缺乏有效的登革熱及茲卡病毒感染症疫苗與處方藥劑,因此病媒蚊數量控制仍為防治疫情擴散的主要方式。目前埃及斑蚊的防治仍舊以化學藥劑防治為主,而持續的施用化學藥劑防治極易促使埃及斑蚊產生抗藥性,甚至於交互抗性,使原本數量極其有限的防治藥劑更顯侷促。因此本研究的首要目的是以抗百滅寧 (permethrin)的Per-R及抗安丹 (propoxur)的Prop
-R品系埃及斑蚊為例子,探究此二品系埃及斑蚊是否對防治埃及斑蚊常用的藥劑產生交互抗性;其次利用次世代定序 (next generation sequencing)與比較轉錄體分析 (comparative transcriptome analysis),更全面的了解埃及斑蚊的抗藥性機制,以利抗藥性抑制劑的研究。 從抗百滅寧Per-R與抗安丹Prop-R品系埃及斑蚊的幼蟲及成蟲藥劑試驗得知:(1) Per-R品系幼蟲對合成除蟲菊酯類藥劑的抗藥性皆高於800倍,但是對於安丹、陶斯松與撲滅松等乙醯膽鹼酯酶抑制劑的抗藥性則低於10倍。(2) Per-R品系雌成蟲對合成除蟲菊酯類藥劑的抗擊昏倍率較
幼蟲抗藥性低,介於2.9-32倍,對安丹卻只有3.2倍的抗擊昏倍率。(3) 源自於Per-R的Prop-R品系,經過安丹約30代的篩選,雖然幼蟲只對安丹產生6.8倍的抗藥性,雌成蟲也只對安丹產生6.6倍的抗擊昏能力,但是對合成除蟲菊酯類的藥劑仍保留一定程度的幼蟲抗藥性 (21-242倍)與雌成蟲抗擊昏能力(2-27倍)。簡言之,以百滅寧篩選的Per-R品系幼蟲對其他合成除蟲菊有極高的交互抗性 (cross resistance),對於安丹等乙醯膽鹼酯酶抑制劑的交互抗性卻很有限,但是雌成蟲對其他合成除蟲菊與安丹卻有不同程度的交互抗性,其中對賽扶寧的交互抗擊昏作用最低。另外,Per-R幼蟲抗藥程度
遠高於雌成蟲的抗擊昏能力意味著,除了作用部位不敏感之外,尚有其他抗藥性機制參與其中。從NS感性品系與Per-R、Prop-R抗性品系的比較轉錄體分析 (comparative transcriptome analysis) 發現多個可能與表皮穿透能力降低、生物轉化 (biotransformation)作用增強、排泄能力增強相關的基因參與其中,例如:表皮蛋白 (cuticular protein)、細胞色素P450 (cytochrome P450, CYP)、穀胱甘肽轉移酶 (glutathione S-transferase)、酯酶 (esterase)、葡萄糖醛酸轉移酶 (UDP-glu
curonosyltransferase)、ABC運輸蛋白 (ATP-binding cassette transporter)與溶質載體 (solute carrier)等基因。在這些基因產物中,表皮蛋白在Per-R與Prop-R品系埃及斑蚊幼蟲的表現量高低呈現相反趨勢,在Per-R及Prop-R品系幼蟲與雌成蟲發現過量表現的CYP多屬CYP6及CYP9。雖然大量溶質載體可能參與Per-R與Prop-R埃及斑蚊對百滅寧或安丹的抗藥性,但相關角色功能於昆蟲尚不清楚。
發展及應用新穎反向遺傳技術以研究黃病毒 之生活史
為了解決zs-3030 的問題,作者吳仁煌 這樣論述:
反向遺傳技術是一種用於研究單股RNA病毒的強大工具,並且幫助我們對病毒基因功能之瞭解。之前,我們透過將登革熱病毒與日本腦炎病毒的部分序列進行同義突變(silent mutation),而成功的降低病毒基因體在細菌內的大腸桿菌啟動子(ECP)活性,並且得到登革熱病毒與日本腦炎病毒的RNA-launched感染性cDNA。然而,對於黃病毒的DNA-launched感染性cDNA之構築,由於病毒蛋白的表現,仍然無法在細菌內穩定表現。我們透過將七個重複的四環素誘導反應子(7XTRE)與巨細胞病毒的微小啟動子(CMVmin)序列置於病毒基因體的前端,成功的表現登革熱病毒與日本腦炎病毒的DNA-laun
ched感染性cDNA。經由測量融合水母冷光酶基因與登革熱病毒或日本腦炎病毒的部分序列的融合質體之活性,將7XTRE與CMVmin序列置於病毒基因體的前端,有助於降低病毒基因體在細菌內的大腸桿菌啟動子活性。由DNA-launched感染性cDNA所衍生的登革熱重組病毒與日本腦炎重組病毒的成長曲線,與各自的parental viruses的成長曲線相似。同樣的,將7XTRE與CMVmin序列、五個重複的GAL4序列或五個重複的BamHI linkers序列各置於登革熱病毒基因體的前端,都可以成功的表現登革熱病毒的RNA-launched感染性cDNA。這三種重複序列皆會降低病毒基因體在細菌內的大
腸桿菌啟動子活性。此外,7XTRE與CMVmin序列會穩定日本腦炎病毒的RNA-launched感染性cDNA以及降低病毒基因體在細菌內的大腸桿菌啟動子活性。由RNA-launched感染性cDNA所衍生的登革熱重組病毒與日本腦炎重組病毒的成長曲線,與各自的parental viruses的成長曲線相似。這些結果都支持這種可用於構築黃病毒的感染性cDNA的新穎方法。為了進一步應用我們的新穎反向遺傳技術,我們以登革熱病毒的DNA-launched感染性cDNA為基礎,配合丙胺酸突變掃描技術(alanine scanning mutagenesis),研究登革熱病毒的NS2A蛋白。登革熱病毒的NS
2A蛋白有8個跨膜區域 (pTMS1-8)。研究指出NS2A蛋白會參與病毒的RNA複製、病毒顆粒組裝以及宿主細胞的抗病毒反應。然而,對於NS2A蛋白的位於跨膜區域的胺基酸序列在病毒的生活史中所扮演的角色知之甚少。我們以登革熱病毒的DNA-launched感染性cDNA與複製子為基礎,將靠近NS2A蛋白C端(pTMS4-8)的胺基酸置換成兩個或三個的丙胺酸,藉此研究NS2A蛋白的功能。在35個病毒突變株中,有14個病毒突變株(其中8個突變株的突變點是位於pTMS8)的RNA複製受到破壞,呈現致死表現型。突變點位於pTMS7的病毒突變株:CM20、CM25與CM27,則呈現病毒表現量下降、類似野生
型病毒的RNA複製能力、似病毒粒子(virus-like particles)表現量下降,代表這些突變株的病毒組裝或釋出能力有缺陷。藉由分析由CM20、CM25與CM27病毒突變株所衍生的revertant viruses之序列,發現皆在NS2A的第181個胺基酸(位於pTMS7) 產生一個由leucine (L)突變成phenylalanine (F)的突變(L181F)。將L181F的突變置入NS2A突變株的感染性cDNA,例如:CM20、25與27,可以使突變株的活性幾乎恢復到野生型病毒的活性。此外,L181F的突變也會挽救RNA複製能力嚴重缺陷的突變株,例如:CM2、3、13、31與3
2。最後,這些結果反映出NS2A的pTMS4到8的區域,在病毒的RNA複製與病毒組裝、釋出中,扮演著重要角色,也指出pTMS7與pTMS4、6與8之間具有分子內作用力。
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