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I.小鼠AIE1蛋白質激脢的基因構造及啟動子特性之分析II.細胞核分裂蛋白NuMA在小鼠胚胎發育時的表現及功能分析

為了解決smrt 59單套的問題，作者胡惠美 這樣論述：

I. 小 鼠 AIE1 蛋 白 質 激 脢 的 基 因 構 造 及 啟 動 子 特 性 之 分 析 本實驗室最早發現兩個新的睪丸 (testis) 組織特有之蛋白質激， (protein kinase)，分別命名為小鼠 AIE1 及人類 AIE2 (Tseng et al., 1998)。它們的蛋白質激脢功能區域 (catalytic domain) 之胺基酸序列，與果蠅的 Aurora，酵母菌的 Ipl1，及 Xenopus 的 Eg2 有很高的相似性。在此，我報告小鼠 AIE1 基因結構及其序列，並分析 AIE1 基因調控區 (promoter) 上 cis-acti

ng elements 的結構及其與 transcription factors 交互影響。另外我亦分析在睪丸發育過程中，AIE1 mRNA 的表現情形及 AIE1 基因在染色體上的位置。 以 RT-PCR 分析 AIE1 mRNA 在各組織的表現，發現 AIE1 的表現主要局限在腎、睪丸、及精子上。至於卵子，及早期胚胎發育時期 (1.5 d.p.c. 到 3.5 d.p.c.)，則 AIE1 不表現。另外以 Northern blot 及 RNA in situ hybridization 分析得知，AIE1 主要是表現在 late pachytene spermatoc

yte (粗絲期精細胞後期)，即減數分裂時期的精細胞，故相信 AIE1 kinase 與減數分裂必有密切關係。 由篩選小鼠的 genomic library，得到完整的 AIE1 基因序列。AIE1 基因約 8 kb 長，包含有 7 個外顯子 (exon) 及 6 個內含子 (intron)，我以引子延伸反應 (primer extension assay) 發現 AIE1 有兩個轉錄起始點。一為 PE1 (minor form)，是由已知 AIE1 cDNA (103d clone，Tseng et al., 1998) sequence 序列前 -34 bp 處開始轉

錄；另一為 PE2 (major form)，是由 -18 bp 處開始轉錄。此 AIE1 基因的 exon/intron 交界處序列，符合 GT/AG 裁剪規則。而人類的 AIE2 基因已可在基因庫中找到。比較兩者，可發現 AIE1 與 AIE2 非常類似，尤其在蛋白質激脢功能區域 (catalytic domain)。人類的 AIE2 基因已知在染色體 19q13-ter 上。而小鼠的 AIE1 基因，我也以螢光原位雜交 (fluorescence in situ hybrdization) 的方式，定位在染色體 7A2-A3 上。 我以各種系列刪剪的 AIE1 pro

moter (AIE1p) regions，接在螢光素脢 (luciferase，Luc) 報導基因上，轉染細胞，以測試 luciferase (Luc) 的活性。發現 nt. -659 ~ -583 (from translation start site) 對 PE1 的 transcription 影響較大。可是對 PE2 而言，其 transcription 是受位於 nt. -442 ~ -343 的區域所影響。且知 Sp1/hsp70 對 PE2 的 transcription initiation 很重要。而 CRE-like element (nt. -1093 ~ -11

03)，對 AIE1 的表現，似乎有重要影響。至於研究其他的 transcription factor 或蛋白質激脢 ( protein kinase) 對 AIE1p 的影響，則可見 PKA 具加強 (activate)，MEKK-1 是抑制效果 (inhibition)；l-TZFP 具有 repressor 效果，而 s-TZFP 則具有 activator 效果，且不論是否有 TBS site 的存在。 另外我以電泳膠片遲滯反應 (electrophoresis mobility shift assay，EMSA)，證明了 AIE1 promoter 某些特定區域

對睪丸細胞核萃 取液有專一性結合。再以競爭性電泳膠片遲滯反應，找出是那一個特別的核甘酸，對 AIE1p 與 TZFP 與 CRE 結合蛋白的專一性結合，影響最大。此結果將有助於未來對睪丸專一性表現之基因的調控機轉之瞭解。 II. 細 胞 核 分 裂 蛋 白 NuMA 在 小 鼠 胚 胎 發 育 時 的 表 現 及 功 能 分 析 細胞核分裂蛋白 (Nuclear Mitotic Apparatus protein，NuMA) 最早由 Lydersen 和 Pettijohn 於 1980 年提出。此蛋白在細胞間期 (interphase) 存在細胞核中

，但在細胞分裂期間 (mitosis)，又集中在細胞的紡綞極中 (spindle pole)。最近人類 NuMA 基因的整個 cDNA 的序列已被解出 (Compton et al., 1992 及 Yang et al., 1992)。三級結構中可看出是 NuMA 以一長形 alpha- helix 的結構為中心，兩邊接著球狀結構所組成。 我們最近發現人類的 NuMA 具有 3 種變化裁剪 (alternative splicing) 之訊息核糖核酸 (mRNA) 存在，它們都是由 單一個基因而來，主要不同是在C- 端之序列。其中大型 NuMA (T33 / p230)

form 量最多，也是早期被選殖出，其表現型態主要位於 interphase 的細胞核內；但中型 (U4 / p195) 及小型 NuMA (U6 / p194) isoforms 則是在細胞間期存在細胞質及中心體 (centrosome) 上，到細胞分裂時則移至紡綞極 (spindle pole) (Tang et al., 1993, 1994 )。 在成熟小鼠的卵細胞，中心粒 (centrioles) 被報告是在囊胚期 (blastocyst stage) 才出現。所以早期小鼠的胚胎發育，提供了一個特殊的實驗材料，探討在沒有中心粒存在下，微小管核心化 (microtu

bule nucleation)，及紡綞體形態變化的機制。 為研究在小鼠卵形成及胚胎發育時，各種 NuMA isoforms 不同表現。首先，我得先選殖及分析小鼠的 NuMA cDNA sequence；並以引子延伸反應 (primer extension assay) 定其轉錄起始點。而後再以反轉錄脢-聚合脢鏈反應 (RT-PCR) 的方式，分析在小鼠各組織及在早期小鼠胚胎發育期間的各種 NuMA isoforms 表現。結果發現 NuMA-l isoform 在小鼠各組織及在早期小鼠胚胎發育期間都有表現。NuMA-m isoform 也是在小鼠各組織及早期胚胎都有表現，

但唯獨在精子中不表現。NuMA-s isoform 則一直偵測不到。結果亦顯示大部分組織是只有 +42 bp isoform，而睪丸及腎臟則兩種 +42 bp 及 42 bp isoforms 都存在；未受精卵及早期胚胎只有 -42 bp isoform，而受精卵則直到 3.5 d.p.c 才出現 +42 bp isoform。 最後，我以顯微注射 (microinjection) 的方式，將 NuMA 反向核酸引子 (antisense oligomers) 或抗體 (polyclonal antibodies) 注射至小鼠的早期胚胎中，來抑制 NuMA 表現，看胚胎是否

會因此而不正常分裂。結果，發現注射抗體的一組，的確會抑制 NuMA 的表現，且會使胚胎不正常分裂。故我們推測 NuMA 蛋白可能參與早期胚胎細胞分裂的過程。