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建構酵母菌表面呈現系統用於表現脂肪酶及β-葡聚醣酶

為了解決focus柴油缺點的問題，作者陳鐿壬 這樣論述：

酵素發展至今已有一百多年歷史，種類多元且大幅降低化學反應所需時間，因此極具商業應用價值。為增加離乳仔豬對飼料營養成分之吸收，防止因抗營養因子消化不良所引起之下痢，透過飼料添加酵素可改善此現象。經由基因工程蛋白表現系統量產目標酵素為目前研究努力方向。本研究探討之脂肪酶及 β-葡聚醣酶是具商業價值之酵素，廣泛應用於食品、清潔劑、生質能源及家畜飼料之添加等產業。本實驗室已成功利用大腸桿菌表現系統表現脂肪酶，證實利用於腸胃道尚未發育完全之小豬，其營養吸收具更佳之效果，透過飼料添加酵素分解後提高營養吸收率並加速其成長。本研究研發酵母菌表面呈現系統 (yeast surface-displayed sy

stem)將酵素經由酵母細胞壁鑲嵌蛋白 pir1 呈現於酵母菌表面，因此酵母菌表現之酵素可直接添加於飼料。結合本實驗室先前研發之低濃度 0.005% 葡萄糖誘導啟動子 (GTH1 promoter)，改善傳統嗜甲醇巴斯德畢赤酵母菌 (Pichia pastoris)需利用昂貴及高危險性之甲醇作為誘導劑之缺點，可減少誘導期間所需碳源及誘導劑，達降低生產成本之目的。此外，為提升脂肪酶與 β-葡聚醣酶之表現量，將目標基因序列優化及建構兩套及四套之多套表面呈現之載體，以提升酵素產量及符合產業化需求。本研究先以表現 eGFP 確認系統可行性後，再將脂肪酶與 β-葡聚醣酶之優化基因構築於酵母菌表面多套呈現

載體 (pA4GTH pir1 His)。線性質體 DNA 電穿孔於 P. pastoris GS115，以 2000 μg /ml 之高濃度 ZeocinTM 挑選高度同源重組菌株，經 0.005% 葡萄糖誘導 72小時後，以免疫螢光染色法及西方墨點法確認酵素表現。在活性分析結果發現以四套表現載體之轉殖株較單套提升2至4倍之活性，證實套數與酵素活性成正向關係。脂肪酶及 β-葡聚醣酶之生化活性分析結果顯示，兩者之最佳反應溫度分別為 85℃ 及 75℃，最適反應 pH 環境則為 pH 7.0 與 pH 6.0，而在55℃ 至 85℃ 之熱穩定性及 pH 3.0 至 pH 8.0耐受性處理後，脂肪

酶及 β-葡聚醣酶仍具有活性；於腸胃道環境模擬測試，在 0.5% pepsin 及 0.5% trypsin作用後，皆仍維持高活性。因此本研究建立之 P. pastoris 表面呈現系統，不僅大幅減少蛋白量產步驟降低生產成本，且脂肪酶及 β-葡聚醣酶皆於高溫環境具高活性及產業化價值。