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以蛋白質體學鑑定及免疫分析橘青黴菌分泌性過敏原，並探討Penc13誘導人類肺上皮細胞的發炎反應

為了解決cla35 shooting brake的問題，作者邱莉莉 這樣論述：

摘要青黴菌是引起室內過敏最主要的過敏原之一，若吸入此黴菌的孢子則會引發呼吸性的過敏症狀。然而在文獻上卻僅有少部分青黴菌過敏原曾經被報導過。而在台北都會地區，橘青黴菌 (Penicillium citrinum) 則是具有高度盛行率和致病性的過敏性黴菌，但卻也如同一般的青黴菌一樣，在學術界中未曾被深入的探討與研究。因此，本論文的研究主題主要是以橘青黴菌分泌性過敏原為研究對象，並分為以下兩大研究主軸來進行。第ㄧ部份是利用蛋白質體相關技術，來分析並鑑定橘青黴菌培養分泌物中的可能致敏分子，並探討其免疫特性。第二部份則是研究其中ㄧ個主要的橘青黴菌過敏原 Pen c 13， 在誘導人類肺上皮細胞釋放化學

激素或是相關細胞激素的可能機制。分析並鑑定過敏原分子的身份及免疫特性，是研究過敏機制最基本也是最困難的首要工作。而基於蛋白質體學相關技術的蓬勃發展，相形之下，這些研究工作也較過去來的準確許多。我們首先是以蛋白二維電泳技術，嘗試解析橘青黴菌中所有分泌性蛋白質，並建立這些蛋白質與黴菌過敏病人的 IgE 反應圖譜。我們結合液相層析串聯式質譜和蛋白質 N-端定序技術，則成功地鑑定出一個已被報導過的重要過敏原 Pen c 13 以及四個全新定義的過敏原;分別是 Cu/Zn superoxide dismutase、pectate lyase (Pen c 32)、glucanosyltransferas

e (GEL1) 以及 catalase (Pen c 30)。其中我們將針對 Pen c 30 來進行免疫特性分析，因為我們發現 Pen c 30 會與 48% 患有黴菌過敏病人血清中的 IgE 結合。而透過純化、cDNA 選殖、生化特性以及免疫分析等方法，我們也確實證明 Pen c 30 與 IgE 結合的高活性和致敏特性。同時也發現 Pen c 30 為ㄧ經過醣分子後修飾的醣蛋白，而且這些醣基分子對 Pen c 30 的致敏特性則扮演了決定性的角色。而至於另ㄧ個過敏原 Pen c 13 ，我們也發現它除了會與 76% 黴菌過敏病人血清中的 IgE 結合外，同時也會與 Asp f 13 有

IgE 交叉反應，並且強烈誘導黴菌過敏病人引發立即性過敏反應。另一方面，經由 Pen c 13 的 IgE 抗原決定點之圖譜分析，我們在大腸桿菌中表現ㄧ段重組的 Pen c 13 最主要 IgE 抗原決定點的胜肽片段， Pen c 13 (T261~K274) 外，也證明此胜肽對 Pen c 13 過敏病人之 IgE 的強烈反應。更進ㄧ步發現 ，Pen c 13 (T261~K274)(T272A) 或 (K274A) 的單點突變，將會減少或完全地喪失此胜肽的 IgE 結合能力。這個結果顯示 T272 和 K274，在 Pen c 13 與 IgE 結合構形中是非常重要的胺基酸殘基。從文獻中

我們清楚地知道，某些已知的致敏性過敏原，本身即具有絲胺酸蛋白酶的酵素活性，並且是造成氣喘的重要致病機制之一。而至於其相關的活化機制則仍然不是很清楚。相對地，我們也發現 Pen c 13 亦為一鹼性的絲胺酸蛋白酶。因此，在本論文的第二部份，我們將進一步探討，Pen c 13 是否同樣會利用其酵素活性，透過活化肺上皮細胞的蛋白酶活化膜受器 (protease-activated receptors，PARs) ，來誘發化學激素 IL-8 的釋放。首先我們發現， Pen c 13 在刺激 A549 細胞後，會誘導 IL-8 的釋放外，也會立即誘導細胞內鈣離子移動至細胞質中；並因而使得細胞對其他 PA

R-1 和 PAR-2 活化物的作用喪失敏感性 (desensitization)。但若 A549 細胞是處在無鈣離子存在的培養基中，則 Pen c 13 便無法誘導細胞 IL-8 的釋放。更進ㄧ步的實驗亦證實，當肺上皮細胞先被處理抗 PAR-1 和 PAR-2 切位的抗體後，則會抑制 Pen c 13 誘導細胞 IL-8 的產生。相反地，另一抗 PAR-4 的抗體卻無法造成此一抑制現象。這個結果清楚地說明了 Pen c 13 透過 PAR-1 和 PAR-2 而非 PAR-4 膜受器的選擇性作用機制。 同時我們也明確地證實 Pen c 13 的確會正確地切在 PAR-1 與 PAR-2 的蛋

白酶切位上。而磷脂酶 C (phospholipase C) 的抑制劑也可達到與此類似的抑制效果，更強化了 Pen c 13 與鈣離子作用的緊密關係。 除此之外，Pen c 13 誘導 A549 細胞 IL-8 的表現則是經由 ERK ½ 的活化 ，而不是透過 p38 和 JNK 的活化。並且 Pen c 13 增加 ERK1/2 的磷酸化是經由鈣離子相關路徑。這些結果顯示 Pen c 13 誘導人類肺上皮細胞 IL-8 的釋放，是透過 PAR-1 和 PAR-2 的活化機制，並且和細胞內鈣離子相關路徑有密切的關係。總結本篇論文的結論，我們是首次以蛋白質體方法，鑑定出橘青黴菌四個新分泌性過敏原

。而透過這些新過敏原的發現，將可應用於過敏診斷以及黴菌過敏疾病之治療。並且在 Pen c 13 最主要 IgE 抗原決定點上的研究結果，將有助於設計此過敏原的低過敏性構形的研發。除此之外，Pen c 13 誘導人類肺上皮細胞 IL-8 的釋放機轉，則被證實是經由 PAR-1 和 PAR-2 的活化以及細胞內鈣離子相關路徑有關。這些成果，將可促進我們對過敏性呼吸道疾病的病理機制，提供一個新的研究與過敏治療方向。