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國立海洋大學 食品科學系 江善宗、唐世杰、陳慶三所指導 陳俊宏的 雞半胱胺酸蛋白「酶」抑制劑之選殖、表現、醣化修飾及於魚漿加工上之應用 （2000），提出Mini Soda 2023關鍵因素是什麼，來自於雞半胱胺酸蛋白水解酵素抑制劑、冷凍安定性、醣化修飾、魚漿、解膠。
雞半胱胺酸蛋白「酶」抑制劑之選殖、表現、醣化修飾及於魚漿加工上之應用
為了解決Mini Soda 2023 的問題，作者陳俊宏 這樣論述：
鯖魚(Scomber australasicus)、鱈魚(Merluccius productus)、鮭魚(Oncorhynchus keta)、大西洋產鱈魚或比目魚等魚漿在冷凍貯藏過程中極易因Cathepsins B, H, L等之殘存而造成品質下降，而且於製造魚漿加工品時，常會在加熱過程發生魚漿解膠(thermal degradation)之品質劣變問題，由過去就上述魚類肌肉蛋白的純化與生化特性分析，以及各種蛋白抑制劑應用於改善該類魚漿品質之研究結果，顯示cathepsin B、cathepsin L等硫氫蛋白均會影響魚漿蛋白質的冷凍安定性及其熱凝膠特性，由於從農、畜、水產之原料中
分離與製備蛋白抑制劑極不經濟，且產量也受限。所以本研究室將雞肺的cystatin以及與thioredoxin融合之cDNA序列接到pET-23a(+)表現載體上並將此載體轉形到大腸桿菌AD494(DE3)pLysS細胞內，再經由isopropyl-b-D- thiogalactopyranoside (IPTG)誘導，可於此大腸桿菌細胞質內表現出高量具有正確蛋白分子內雙硫鍵之重組硫氫蛋白抑制劑(A)，此重組硫氫蛋白抑制劑(A)可經由簡單之加熱及Sephacryl S-100 HR膠過濾管柱層析而純化，且其活性與純化自雞蛋中的天然硫氫蛋白抑制劑活性相近。雖然Thioredoxin之融合對
此重組蛋白之可溶態表現量有提升之效果，但重組硫氫蛋白抑制劑(B)之N端融合此Thioredoxin後對papain之抑制活性卻顯著下降，且此融合之Thioredoxin部分會被papain水解。基於安全及工業上量產之考量，本研究室亦將此硫氫蛋白抑制劑(C)以及N-Q-108I ®N-Q-108T醣基化修飾之硫氫蛋白抑制劑(D)的cDNA序列，分別接到pGAPZaC表現載體上並將此載體轉形入酵母菌Pichia pastoris X-33細胞中，之後令cystatin cDNA整合到此酵母菌核內之染色體DNA上，經由此載體上之GAP promoter的調控及α-factor preprose
quence之引導便可以於培養液中大量的表現出具有正確蛋白結構及活性之胞外分泌型重組硫氫蛋白抑制劑。此recombinant chicken cystatin (C)可先後經由40-60 %硫酸銨分化、Sephacryl S-100 HR及Superdex 75膠過濾管柱層析而純化。而Asn106-glycosylation modified cystatin (D) 則可先後經由Sephacryl S-100 HR、 Con A Sepharose及Superose 12 管柱層析而純化。此recombinant cystatin (C)與papain間之抑制常數(Ki值)為0.08 nM
與天然chicken cystatin (Ki = 0.05 nM)相近。將其添加到魚漿中可顯著抑制魚漿蛋白在加工過程中受內生性蛋白水解之現象。此醣基化修飾之重組硫氫蛋白抑制劑(D)對木瓜酵素之抑制屬於競爭型抑制機制，其抑制活性(Ki = 9.5 nM)雖不及於天然雞蛋白之硫氫蛋白抑制劑，但本實驗結果顯示Asn106醣基化修飾可顯著提升雞硫氫蛋白抑制劑之冷凍安定性。