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國立臺灣大學 醫學檢驗暨生物技術學研究所 方偉宏所指導 曹禮醫的 利用質譜儀進行DNA修飾的酵素學研究 （2019），提出MINI R59關鍵因素是什麼，來自於基質協助雷射去吸附離子化-飛行時間質譜儀、DNA甲基化、DNA磷酸酸化、DNA去磷酸化、EcoRI甲基化酶、CpG甲基化酶、T4多核苷酸激酶、小牛腸鹼性磷酸酶。
利用質譜儀進行DNA修飾的酵素學研究
為了解決MINI R59 的問題，作者曹禮醫 這樣論述：
MALDI-TOF質譜儀被廣泛運用於許多領域，包括:胺基酸、蛋白質、核酸、微生物等分析，又其高解析力特點可偵測DNA上不同鹼基中微小質量的差異，已被應用於單核苷酸引子延伸法中，亦即使用無標記的雙去氧核醣核苷酸三磷酸(ddNTPs)進行引子延伸反應，再以MALDI-TOF分析，即可得知基因特定位置的多形性。先前實驗室學長姊將單核苷酸引子延伸的概念延伸應用於探討第一型聚合酶對於internal mismatch的校正能力。因此我想探討MALDI-TOF質譜儀在檢測DNA修飾上的可行性，包括:DNA甲基化、DNA磷酸化與DNA去磷酸化。首先，先以EcoRI methyltransferase測試，
發現給予8 U EcoRI methyltransferase反應16小時可以使單股含一特異性甲基化位點的寡核苷酸DNA序列全部加上甲基，於圖譜上呈現比原訊號多14分子量的訊號。同樣給予8 U EcoRI methyltransferase反應10、20、30分鐘，可分別得到32.43%、51.26%、58.86%的甲基化反應效率。確定MALDI-TOF質譜儀可成功檢測DNA甲基化後，我接著測試CpG methyltransferase (M. SssI)，給予2 U M. SssI反應30分鐘可以發現有30.1%的引子股被甲基化，給予4 U反應30、60分鐘則分別有67.2%和76.5%的引
子股被甲基化，並發現2 U與4 U反應30分鐘時存在劑量依賴性的現象。 我也對DNA磷酸化修飾以MALTI-TOF MS進行偵測，給予0.1、0.5的T4 polynucleotide kinase分別反應10分鐘，都發現於圖譜上顯示比原訊號向右位移78的分子量，表示於單股寡核苷酸序列的5’端加上一個磷酸根。給予0.05、0.1 U分別反應1、3分鐘，發現0.1 U反應1分鐘有56.06%的反應產物，3分鐘則全反應；0.05 U反應 1分鐘有 8.43%的反應產物，3分鐘有27.73%的反應產物。 最後測試DNA的去磷酸化，我以於5’端有磷酸化修飾的P3U-5'P單股寡核苷酸序列為
受質，給予0.1 U的Calf intestinal alkaline phosphatase反應1分鐘，可於圖譜上發現比原訊號向左位移78的分子量，代表原本的寡核苷酸上的磷酸根被去除。給予0.0001 U反應1分鐘有12.43±0.62%，2分鐘有18.26±0.80%，3分鐘有22.93±1.27%的反應產物；0.0002 U反應1分鐘有21.99±3.37%，2分鐘有34.20±2.58%，3分鐘有50.30±9.18%的反應產物；0.0004 U反應1分鐘有67.15±9.61%，2分鐘有74.66±6.43%，3分鐘有83.61±2.27%的反應產物。 經初步研究顯示，MALD
I-TOF質譜儀適用於測定核酸修飾蛋白的活性。