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國立成功大學 臨床藥學與藥物科技研究所 莊偉哲所指導 張永昇的 利用第三型纖連結蛋白的第九個且/或第十個模組片段設計對整合蛋白alpha5beta1且/或alphavbeta3有專一性的拮抗劑並進行結構鑑定與生醫應用 （2012），提出FN2 Type R關鍵因素是什麼，來自於整合蛋白、纖維連結蛋白、拮抗劑、專一性、溶解度、熱穩定度、結構、血管新生、癌症治療。

而第二篇論文國立成功大學 環境工程學系 黃 汝 賢所指導 蔡建成的 單一污泥系統硝化/脫硝之動力學(涵蓋硝化菌分率/脫硝酵素分率) （2000），提出因為有 單一污泥型前脫硝系統、二段式硝化動力、二段式脫硝動力、Nitrobacter分率、亞硝酸鹽還原酵素分率、鹼度改變量、動力模式、模式應用的重點而找出了 FN2 Type R的解答。

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利用第三型纖連結蛋白的第九個且/或第十個模組片段設計對整合蛋白alpha5beta1且/或alphavbeta3有專一性的拮抗劑並進行結構鑑定與生醫應用

為了解決FN2 Type R的問題，作者張永昇 這樣論述：

整合蛋白 (integrins) 為穿越細胞膜的接受器，可調節細胞與其周遭組織如其他細胞以及細胞外間質的黏著，整合蛋白也參與細胞的訊息傳遞，因而影響細胞的形狀、移動以及細胞週期的調控，纖維連結蛋白 (fibronectin) 是一個會與整合蛋白結合的細胞外間質糖蛋白，纖維連結蛋白的組成包含有第一型 (Fn1) 、第二型 (Fn2) 及第三型 (Fn3) 三種不同類別的重複性單元 (homologous repeating domains)，其中第一型 (Fn1) 有12個，第二型 (Fn2) 有2個，第三型 (Fn3) 有15-17個，已知，第三型重複性單元的第九個與第十個模組 (modul

e) 片段 (9,10Fn3) 或第十個模組 (module) 片段 (10Fn3) 可以分別與整合蛋白 α5β1 或 αvβ3 有辨識作用，但運用9,10Fn3 和10Fn3設計對整合蛋白的拮抗劑，必須使其具有較高的溶解度、穩定度、選擇性及活性，因此，本研究我們欲使用 9,10Fn3 和 10Fn3 作為鷹架蛋白 (scaffold) 來分別設計出對整合蛋白 α5β1 和/或 αvβ3 有專一性的拮抗劑 (integrin-specific antagonists)，期望: (1) 藉由結合去整合蛋白 (disintegrin) 的序列以及改變 RGD loop 上雙硫鍵的鍵結模式 (CX

nC)，來設計出對整合蛋白 α5β1 和/或 αvβ3 有專一性的突變株; 並且，(2) 對專一性的突變株進行特性分析; 同時，(3) 探討專一性突變株之結構與功能間的關係; 最後，(4) 評價專一性突變株其應用上的意義。目前，已成功地用大腸桿菌表現系統表現出多於20種 9,10Fn3 和 10Fn3 及其突變株，且可以得到純的蛋白產物; 根據核磁共振 (NMR) 分析的結果顯示出，9,10Fn3 和10Fn3及其突變株有正確的摺疊 (fold); 而在加入一對雙硫鍵於 9,10Fn3 和 10Fn3 的RGD loop後，突變株會分別對 α5β1 或 αvβ3 有較高的親合力 (affini

ty) 與選擇性 (selectivity)，從血小板凝集實驗的結果顯示，Fn3系列突變株較不會影響血小板凝集，表示其較不會引起血小板缺乏症; 利用蛋白抑制細胞黏著性試驗的結果顯示，含有CX8C雙硫鍵的鍵結模式之9,10Fn3突變株對整合蛋白 α5β1 有較高專一性 (specificity)，而含有CX7C雙硫鍵的鍵結模式之10Fn3突變株則對整合蛋白 αvβ3 有較高專一性，並且我們篩選到 9,10Fn3L1408P(CRARGDNPDC) 為能專一性地抑制整合蛋白 α5β1 的突變株，其半抑制濃度為67 nM，而 10Fn3(CPRGDMPDC) 為能專一地抑制整合蛋白 αvβ3 的突變

株，其半抑制濃度為93 nM; 此外，含有一對雙硫鍵的突變株，不僅有較高活性，更具有較高的溶解度 (solubility) 與熱穩定度 (thermostability); 經由大小排阻層析 (SEC) 搭配多角雷射光散射 (MALLS) 方法分析顯示，具專一性的突變株皆以單體 (monomer) 存在於溶液中;由熱分析儀 (DSC) 的結果呈現出，對整合蛋白 α5β1 或 αvβ3 有較高專一性的突變株其半解構溫度 (melting temperatures) 各為62.4 ℃和85.0 ℃; 再由硫酸銨沉澱法 (ammonium sulfate precipitation) 求得其溶解度分

別為24.4 mg/mL和27.8 mg/mL。我們也利用 X-ray 結晶繞射 (diffraction) 方法解得其結構 (structure)，發現專一性突變株與野生株的結構差異，在 RGD loop 的構形和其中的 R 與 D 之呈現有所不同;嵌合模型的建構 (Haddock docking models) 闡明了，對整合蛋白 α5β1有較高專一性的突變株，其與 α5β1 的嵌合模型具有最低的嵌合能量 (docking energy)。從體內與體外的血管生成實驗顯示出，對整合蛋白 α5β1 或 αvβ3 有較高專一性的突變株，可各別地抑制 VEGF 或 bFGF 所誘導的血管新生 (a

ngiogenesis);將突變株應用在將人類癌細胞植入老鼠的模式中發現，對整合蛋白 α5β1 或 αvβ3 有較高專一性的突變株，可分別地抑制人類黑色素瘤細胞 A375 或肺癌細胞 A549 的生長。此研究，我們設計出對整合蛋白 α5β1 的專一性突變株9,10Fn3L1408P(CRARGDNPDC) 以及對整合蛋白 αvβ3 的專一性突變株10Fn3(CPRGDMPDC)，並且證實其具有抑制血管新生的能力，顯示將其應用在癌症治療 (cancer therapy) 上的潛力。

單一污泥系統硝化/脫硝之動力學(涵蓋硝化菌分率/脫硝酵素分率)

為了解決FN2 Type R的問題，作者蔡建成 這樣論述：

本研究提出涵蓋有Nitrosomonas分率、Nitrobacter分率、硝酸鹽還原酵素分率及亞硝酸鹽還原酵素分率之單一污泥型前脫硝系統 (脫硝反應器後接硝化反應器) 之硝化/脫硝動力模式，同時在系統每一試程達穩定狀態下取出污泥，另以獨立批次試驗方法求得硝化菌分率和脫硝酵素分率之估算值。 以單一污泥型前脫硝系統處理含氮廢水 (模擬肉品市場廢水經化學混凝/加壓浮除處理後之水質; COD = 220 ~ 450 mg/L、 NH4+-N = 120 mg/L、TP = 20 mg/L ) 時，在適當之操作條件下 (如NH4+-N負荷、污泥迴流比、混合液迴流比、污泥細胞停留時間

)，系統可發揮極佳之硝化/脫硝能力。將系統八個試程穩定狀態下之操作條件及水質、污泥濃度實驗數據依質量平衡計算，硝化反應器之比硝化速率和脫硝反應器之比脫硝速率分別為0.18∼0.21 mg NH4+-N/mg VSS-d和0.23∼0.30 mg NOx--N/mg VSS-d；系統之CODutili/NOx--Nred比值和廢棄污泥磷含量分別為3.9∼5.2和4.29%∼8.16%。此外，單一污泥型前脫硝系統之鹼度改變量實測值與理論計算值頗為吻合，亦即鹼度改變量之測定頗適合做為監控此一系統之用途。 根據獨立批次試驗 (enrichment culture) 結果，硝化菌之二

段式硝化反應可用Monod型動力描述，動力常數kn1、Ks, n1、kn2及Ks, n2分別為1.73 mg NH4+-N/mg VSS-d、1.71 mg NH4+-N/L、2.27 mg NO2--N/mg VSS-d及12.7 mg NO2--N/L；脫硝菌之二段式脫硝反應分別可用零階和Monod型動力描述，動力常數kdn1、kdn2及Ks, dn2分別為3.56 mg NO3--N/mg VSS-d、0.74 mg NO2--N/mg VSS-d及0.14 mg NO2--N/L。根據獨立批次試驗結果 (污泥分別取自系統八個試程穩定狀態操作下之硝化反應器及脫硝反應器)，單一污泥型前脫硝

系統之Nitrosomonas分率、Nitrobacter分率、硝酸鹽還原酵素分率及亞硝酸鹽還原酵素分率之估算值分別為0.14∼0.34、0.16∼0.31、0.06∼0.14及0.32∼0.47，亦即亞硝酸鹽還原酵素分率佔最大量，此一結果與系統操作期間皆未發生明顯NO2--N累積現象頗為吻合。 單一污泥型前脫硝系統之無氧脫硝反應器及好氧硝化反應器出流水NH4+-N、NO2--N及NO3--N濃度之模式計算值皆與實驗值頗為吻合，且單一污泥型前脫硝系統 NH4+-N和TN去除率之模式計算值亦皆與系統所得之實驗值吻合，足證本研究提出之硝化/脫硝動力模式可被準確地用以預測系統出流

水之水質。最後，根據驗證過之動力模式模擬結果發現，欲使單一污泥型前脫硝系統充分發揮硝化/脫硝能力 (即兼顧NH4+-N和TN去除率)，必須藉由最佳化之工程設計及操作以獲得系統最適當之Nitro- somonas、Nitrobacter、硝酸鹽還原酵素及亞硝酸鹽還原酵素之分佈比例。

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