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利用酵母菌雙雜交法鑑定Argonaute4蛋白與冰花E3 ligase McCPN1具有交互作用

為了解決E53 Coupe的問題，作者李長樺 這樣論述：

冰花（Mesembryanthemum crystallinum L.; ice plant）是一種研究耐鹽機制的模式植物，在特定的生長期間若遭受到高鹽或是乾旱逆境，會誘導特定的反應以適應逆境。McCPN1是從冰花中鑑定出來的一種植物特有的RING-type copine蛋白，其蛋白結構包含在N端負責蛋白間交互作用的copine vWA domain，以及具有ubiquitin E3 ligase活性的really interesting new gene（RING）-finger domain。McCPN1與鹽誘導蛋白McSKD1具有交互作用，藉由ubiquitination修飾McSKD

1間接調控蛋白的運輸。與McCPN1 高度相似的AtRGLG2蛋白具有調節阿拉伯芥對乾旱及鹽逆境的反應，為了瞭解McCPN1參與冰花鹽逆境適應的過程，利用全長的McCPN1進行酵母菌雙雜交試驗，在鹽處理冰花根部的cDNA基因庫篩選有交互作用的候選基因。共挑選120個候選基因與McCPN1具有交互作用，並且利用營養篩選與β-galactosidase活性測試，進一步挑選出E3、E9、E35、E36、E45、E46、E65與E67八個候選基因。其中E3與E9比對到Argonaute 4（AGO4），參與了小分子RNA干擾基因表現的機制；E35是具有galactose-binding domain-

like與Sad 1/ UNC-like（SUN）C-terminal domain的半乳糖結合蛋白(galactose-binding protein)，利用domain分析得知，E35可能參與了細胞吸附、增殖、凋亡、細胞核的固著與移動，以及mRNA的剪接；E36是xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases調控細胞壁的延展性並且參與組織脫落、果實的成長、成熟與老化；E45是具有DCD（Development and Cell Death）domain的蛋白，它可以藉由結合細胞骨架蛋白在細胞中移動，並且參與內質網逆境與滲透逆境下造成的程序性細胞凋亡過程

；E46在DNA序列比對結果是26S ribosomal RNA而在蛋白質序列上則是比對到玉米的一個未知功能的蛋白；E65是熱休克蛋白70，負責蛋白的摺疊、再摺疊、運輸與透過溶酶體或蛋白酶體的方式降解蛋白，並且避免蛋白的凝聚；E67是SPIKE1蛋白，它調節了細胞骨架的排列，維持細胞骨架調控的細胞型態，並且參與了從內質網到高爾基氏體囊泡運輸之早期分泌路徑的動態平衡。根據酵母菌雙雜交試驗的結果推測，鹽逆境下McCPN1可藉由ubiquitination修飾候選蛋白來控制細胞型態、生長與死亡過程，以及協助蛋白運輸、在摺疊與降解。使用增強型螢光蛋白結合上McCPN1的方式來偵測蛋白累積的位置，結果在

原生質膜、內質網與高爾基氏體有螢光蛋白的累積，也發現McCPN1會散佈在細胞質，此現象說明McCPN1廣泛參與細胞各部位的蛋白ubiquitin修飾過程。進一步挑選候選基因AGO4（E3與E9）進行深入的分析，利用快速擴增cDNA片段的方式（rapid amplification of cDNA ends, RACE）鑑定出全長的McAGO4。McAGO4蛋白具有N端DUF1785 domain、位於中間的PAZ domain與C端的PIWI domain。經由成對酵母菌雙雜交試驗（pair-wise Y2H）、pull-down assay、原生質體雙雜交測試（protoplast two-

hybrid）與雙分子螢光互補方法（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）等方式檢測McCPN1與McAGO4的交互作用，結果證實全長的McCPN1與McAGO4具有交互作用但是強度不高，推測可能是蛋白立體空間上排列位置所造成的結果。根據文獻中AGO4的研究結果，AGO4主要累積在細胞核並且參與了RNA主導的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation, RdDM），而BiFC結果發現McCPN1與McAGO4共同累積在細胞核，顯示McCPN1會移動到核內參與McAGO4所催化的反應。綜合以上結果得知，冰花McC

PN1可能參與了許多鹽逆境下的反應，其中之一McCPN1藉由ubiquitination的修飾來調節McAGO4的功能，並且透過RdDM方式調控鹽逆境下的基因表現，進而增加植物對於鹽逆境的忍受度。