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利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀檢測藥物轉運蛋白之轉運基質與創傷弧菌中非典型金屬乙內醯胺酶之特性分析

為了解決Apex S10的問題，作者呂玟蓉 這樣論述：

根據世界衛生組織發布的感染性疾病清單顯示，具有抗生素抗藥性細菌的產生已對人類健康造成巨大威脅。而藥物轉運蛋白跟乙內醯胺酶在細菌的抗藥性中扮演著重要的角色，故鑑定藥物轉運蛋白之轉運基質、定量藥物外排濃度與分析新型乙內醯胺酶的特性極具重要性。目前常規用來測量轉運蛋白外排活性的方法，皆屬於間接證據；分析可能受細菌生長時期及顏色干擾，因此本研究的第一部分為探討利用 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF) 質譜儀監測轉運蛋白外排藥物或染劑的狀態，並與一般常用方法進行

比對。首先，藥物敏感性試驗分析顯示出過表現轉運蛋白 AcrB 可提高大腸桿菌對抗生素及染劑之抗性，且以螢光累積試驗及螢光外排試驗發現 AcrB 能降低染劑在菌體內的累積量。接著，進行MALDI-TOF質譜分析時，首先需最佳化質譜分析參數以維持檢測之精確度，此外，MALDI-TOF質譜分析顯示過表現 AcrB 會使胞外的染劑與藥物離子強度隨著時間增加而升高，這說明了在監測時間中 AcrB 持續的外排累積在胞內的基質。論文的第二部分主要鑑定一個來自創傷弧菌的新型金屬乙內醯胺酶並分析其特性。創傷弧菌是一種常見的致病菌，通常經由攝取未煮熟的海鮮導致感染，感染後死亡率可高達50%。本篇利用基因序列預測創

傷弧菌標準菌株中具有能轉譯出金屬乙內醯胺酶之基因vmh，並分析其聚體型態及受質偏好性，且依結果將其納入Ambler分類系統中。利用SignalP 5.0分析Vmh胺基酸序列預測其在N端包含19個胺基酸訊號胜肽，且顯示 Vmh 蛋白與其他已知的金屬乙內醯胺酶沒有明顯的序列相似性。Vmh 經過誘導表現及親和性管柱純化後，以蛋白質電泳鑑定蛋白質。利用size exclusion chromatography、analytical ultra-centrifuge analysis與electrospray mass spectrometry 分析聚體型態，其結果顯示Vmh 在水溶液中的型態為單體。另

外，在藥物降解試驗上顯示Vmh具有廣效的降解活性包含penicillins、cephalosporins 及 imipenems (kcat/Km為6.23 × 102 to 1.02 × 104 M−1 s−1)，其中 對imipenem 具最高降解活性。值得注意的是，Vmh 的動力學反應表現出sigmoidal curve，顯示協同作用的可能性。通常金屬乙內醯胺酶需要鋅離子來做為活性的輔助，通過加入金屬螯合劑 EDTA 可以發現在鋅離子的存在下，Vmh活性會隨著EDTA的濃度上升而下降，證明 Vmh 需要鋅離子才能水解抗生素。此外，感應耦合電漿質譜的結果顯示 Vmh 可能需要兩個鋅離子才具

有最高的酵素活性，綜合受質偏好性與ICP-MS的結果顯示 Vmh 可能屬於 Ambler class B1。