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國立中興大學 生物科技學研究所 孟孟孝所指導 葉津杏的 剔除3-酮類固醇9α-羥基化酶基因導致Rhodococcus equi菌株於固醇培養基累積雄二烯二酮 （2014），提出1815D關鍵因素是什麼，來自於雄二烯二酮、3-酮類固醇9α-羥基化酵素、鐵氧蛋白還原酶、微生物轉化。
而第二篇論文長庚大學 中醫學系天然藥物 江殷儒所指導 王柏翔的 去硝化菌對睪固酮之無氧降解研究 （2010），提出因為有 睪固酮、Steroidobacter denitrificans、水合酵素、1-testosterone、水合反應、胞外試驗、胞內試驗、代謝質體學、環裂解反應的重點而找出了 1815D的解答。
1815D進入發燒排行的影片
剔除3-酮類固醇9α-羥基化酶基因導致Rhodococcus equi菌株於固醇培養基累積雄二烯二酮
為了解決1815D 的問題，作者葉津杏 這樣論述：
雄二烯二酮(Androstadienedione, ADD)是微生物代謝固醇類化合物中重要的中間產物，可作為多種類固醇藥物生產的前驅物。類固醇藥物被廣泛地用於各種疾病的治療和預防，包括內分泌科、婦科、風濕免疫科以及腫瘤科的臨床應用，大量的需求讓類固醇藥物在製藥工業上佔有重要的地位，因此發展微生物突變菌株以轉化固醇產生ADD具相當之工業效益。目前已知3-酮類固醇9α-羥基化酵素(3-ketosteroid 9α-hydroxylase, KSH)是降解ADD的關鍵酵素，KSH是由鐵氧蛋白還原酶(ferredoxin reductase, KshB)和末端加氧酶(terminal oxygena
se, KshA)所組成，可參與微生物對各種類固醇環系結構之代謝。Rhodococcus equi USA-18 (原命名Arthrobacter simplex USA-18)為膽固醇氧化酶生產菌株。在本研究中，我們根據已知KshB保留區域的胺基酸序列以聚合酶連鎖反應方法從R. equi USA-18中選殖出一段kshB基因。接著利用基因同源重組方法剔除該基因，構建kshB基因缺失的突變株，得到R. equi USA-18∆B8。另外， R. equi F1601 (原生質體融合菌株)中的兩套kshB基因也經由連續同源重組操作而去除，此基因剔除菌株命名為R. equi F1601∆F12。此
二突變株培養在以膽固醇為主要碳源之培養基可累積ADD，顯示突變株已缺乏KSH酵素活性。R. equi USA-18∆B8及R. equi F1601∆F12除了可累積ADD同時也會產生3-oxo-23,24-bisnorchola-1,4-dien-22-oic acid (Δ1,4-BNC)。由巨噬細胞感染試驗確認R. equi USA-18和其突變株均無法在巨噬細胞內生存。在巨噬細胞中不能持續性地生長之特性，可屏除生物安全應用上的疑慮，表明R. equi USA-18、R. equi F1601和其突變株具有工業應用的潛力。最後利用反應曲面法（response surface method
ology, RSM）之Box-Behnken設計分析所篩選出的3個因子Tween 20、酵母抽出物及甘油，運用RSM分析法確定因子之間的交互作用及培養基最佳條件。結果顯示，優化之培養基為0.2％膽固醇-基礎培養基中添加0.5% Tween 20、1%酵母抽出物和1%甘油。將R. equi USA-18∆B8培養於此優化培養基中，ADD最高之累積量為0.65 mg/mL，莫耳轉換率為44.4%。此外將R. equi F1601∆F12培養於0.2%植物固醇-基礎培養基中並添加0.5% Tween 20、1%酵母抽出物和1%甘油，ADD最高之累積量為0.344 mg/mL，莫耳轉換率為25%。綜
合上述結果顯示，R. equi USA-18∆B8與R. equi F1601∆F12能成功累積ADD和Δ1,4-BNC之固醇藥物合成的重要中間體，故R. equi USA-18及其衍生之突變株值得進一步研究其應用之潛力。
去硝化菌對睪固酮之無氧降解研究
為了解決1815D 的問題，作者王柏翔 這樣論述：
固醇類物質調控許多高等生物之重要生理活動。其中，睪固酮及相關之固醇類激素排放至河川、湖泊後將會擾亂環境中生物之內分泌系統。由於固醇類物質之化學結構相當複雜，固醇類物質之降解因此極具挑戰性，尤其在河床底部、污水處理池等無氧環境。根據Fahrbach等人之研究 (2008)，去硝化菌Steroidobacter denitrificans可利用睪固酮作為單一碳源及能量來源，並以硝酸作為電子接受者，於厭氧環境中生長。本研究進一步使用碳-14標定之睪固酮證明此菌株能在無氧狀態下，完全降解睪固酮為二氧化碳。因此，本篇論文以此菌株為模式生物，探索睪固酮之無氧降解途徑。考量現今藥廠在製備固醇類藥物的過程中
，都需要微生物參與生物轉換的過程。本研究因此具有生物技術以及製藥方面的潛在應用價值。至目前為止，我們於胞外試驗中已分別鑑定出此無氧降解途徑的八個初步代謝物。值得一提的是，我們亦發現了一個全新的水合酵素，此酵素可以在沒有任何輔酶的輔助下，利用一分子的水催化1-testosterone之碳-1及碳-2上的水合反應。此外，此酵素並不因氧氣的存在而失去其活性。本研究亦使用碳-13以及碳-14標定之睪固酮進行胞內試驗，並利用代謝質體學之相關分析技術，分離並鑑定出一系列經同位素標定的睪固酮降解之相關衍生物，其中更包括一個疑似為A環裂解反應後的衍生物。因此，本研究推測在無氧條件下，Steroidobacte
r denitrificans首先將裂解睪固酮之A環。根據以上之實驗結果，本論文提出一條前所未見的睪固酮代謝途徑。